● 本文從光合生理研究入手，輔以技術(shù)設計考慮，最后以一個(gè)實(shí)際應用案例的數據展示其結合應用的優(yōu)勢。該研究案例首先使用LI-600篩選對水分脅迫敏感的野生辣椒品種，再結合使用LI-6800針對篩選出的品質(zhì)進(jìn)行深入生理指標研究。LI-600的高通量篩選功能在此得以展現，在一天內使用一臺LI-600測量了500多片葉片樣本，通過(guò)這個(gè)大樣本量調查數據篩選出目標個(gè)體，再使用LI-6800做進(jìn)一步深入全面的植物生理指標分析評估。
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時(shí)間：2021年9月29日 上午10:00-11:00 （第一場(chǎng)）
對應北京時(shí)間9月29日（星期三）晚11:00-12:00
2021年9月29日 下午08:00 （第二場(chǎng)）
對應北京時(shí)間9月30日（星期四）早09:00-10:00
主講人：Jason Hupp
主持人：Rod Madsen
在線(xiàn)答疑應用科學(xué)家：Cici Hall和Ian Smillie
文 | 許燕 劉美玲
圖片來(lái)源 | LI-COR公司
LI-600熒光氣孔測量?jì)x（點(diǎn)擊了解更多）
■ 摘要
LI-600熒光氣孔測量?jì)x是為快速采樣而設計的。它能快速測量葉片的氣孔導度和葉綠素a熒光參數。而LI-6800便攜式光合作用系統則突顯于提供更全面、深入、系統的數據。相對于LI-600只針對氣孔做相關(guān)參數的快速測量，LI-6800測量參數更多（如碳交換相關(guān)參數等），需要花費的時(shí)間也更多。雖然LI-600和LI-6800有不同的用途，但它們提供的數據具有很強的互補性。當它們一起使用時(shí)，可以在很多研究與應用領(lǐng)域提高數據收集與分析的效率，如實(shí)驗室、溫室、植物育種篩選項目等。
本文我們將討論如何使用這兩種儀器在更快的時(shí)間內收集更大的數據樣本，以作更詳細地探索植物生理特征。為了能更加直觀(guān)展現二者結合使用的優(yōu)勢，本文將從光合生理研究入手，輔以技術(shù)設計考慮，最后以一個(gè)實(shí)際應用案例的數據展示其結合應用的優(yōu)勢。該研究案例首先使用LI-600篩選對水分脅迫敏感的野生辣椒品種，再結合使用LI-6800針對篩選出的品質(zhì)進(jìn)行深入生理指標研究。LI-600的高通量篩選功能在此得以展現，在一天內使用一臺LI-600測量了500多片葉片樣本，通過(guò)這個(gè)大樣本量調查數據篩選出目標個(gè)體，再使用LI-6800做進(jìn)一步深入全面的植物生理指標分析評估。
■ 氣體交換和光合作用
葉片進(jìn)行著(zhù)許多復雜的生理過(guò)程，其中如何在葉片內部和大氣之間交換二氧化碳(CO2)和水(H2O)備受關(guān)注。圖1是光合碳同化(CO2)和水汽交換，即蒸騰作用(H2O)這兩個(gè)主要過(guò)程的示意圖，這些氣體通常通過(guò)氣孔進(jìn)出葉片。氣孔能夠對外界刺激或脅迫做出響應，表現為打開(kāi)或關(guān)閉氣孔，以控制交換速率。
隨著(zhù)氣體在葉片內外的擴散，葉綠體中的光合機構開(kāi)始了光合作用。這個(gè)過(guò)程包括發(fā)生在基質(zhì)中的暗反應/卡爾文循環(huán)和發(fā)生在類(lèi)囊體膜上的光反應。
圖1 葉片（上圖）和細胞（下圖）剖面展示LI-600和LI-6800測量的生化過(guò)程
■ LI-600熒光-氣孔測量?jì)x
氣孔計的主要目的是定量化分析葉片和環(huán)境之間的水汽交換。這種交換可以被植物根部從土壤中吸收水分的能力所限制，也可以被葉片氣孔所調節?；谶@些考慮，LI-600的設計旨在環(huán)境條件下準確而迅速地量化這種交換。
LI-600的開(kāi)路式設計確保實(shí)時(shí)測量的結果準確反映了葉片在當前環(huán)境下的狀態(tài)。只要在測量時(shí)不要遮蔭葉片且不改變其角度，就不存在葉片與葉室條件的平衡，就可以快速測量大量的葉片。內置的條形碼掃描器能夠自動(dòng)捕獲數據標簽，無(wú)需手動(dòng)輸入，進(jìn)一步支持高通量調查取樣。
LI-600體積小、重量輕，可以在現場(chǎng)單手操作，并且可以很容易地夾取葉片（圖2）。
圖2 LI-600設計為單手操作
兩個(gè)相對濕度傳感器分別測量空氣與葉片相互作用前、后的濕度值。葉片溫度是用非接觸式紅外熱電偶（IRT）測得。微型泵為系統提供氣流。這種開(kāi)路式設計（流動(dòng)的空氣和準確的流量計）確保LI-600在快速準確獲取總導度基礎上，進(jìn)一步計算出邊界層導度和氣孔導度。
選購LI-600熒光計，LI-600還可實(shí)現測量氣孔導度的同時(shí)，同步測量葉綠素a熒光參數，實(shí)現對光系統 II （PSII）進(jìn)行非侵入性測量，開(kāi)放式設計允許儀器在環(huán)境背景光條件下準確測量，進(jìn)行PSII光化學(xué)相關(guān)研究。
■ LI-6800高級光合熒光測量系統
LI-6800提供的是一套完整的量化光合作用的解決方案。它采用兩個(gè)紅外氣體分析儀(IRGAs)來(lái)量化CO2和H2O的通量。葉片(或整株植物)完全封閉在一個(gè)葉室內，環(huán)境(CO2、H2O、溫度、氣流、光強度和光譜)可以由用戶(hù)控制。
葉室內環(huán)境控制確保在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中保持恒定，測量結果具有直接可比性。LI-6800還允許用戶(hù)改變葉室內測量環(huán)境，并量化葉片對這些變化的響應，如光照(A-Q曲線(xiàn))或二氧化碳濃度(A-Ci)。然而，這樣的測量通常是耗時(shí)的，而且葉室內環(huán)境改變越大，葉片需要的適應時(shí)間就越長(cháng)。
圖3 LI-6800主機、分析器頭部和熒光葉室
LI-6800可配置多種葉室，適用于不同的應用，如測量土壤CO2通量、整株植物氣體交換、藻類(lèi)、水生植物或果實(shí)呼吸/動(dòng)物呼吸等（圖4）。
圖4 LI-6800各種葉室設計從左到右，
上排：3×3 cm透明葉室，擬南芥等小植物葉室，6×6 cm紅綠藍白光源及葉室，自制葉室；
下排：6×6 cm透明葉室，苔蘚葉室，土壤呼吸室，昆蟲(chóng)等無(wú)脊椎動(dòng)物呼吸室。
■ 系統對比
■ 測量參數對比
我們已經(jīng)看到了LI-600和LI-6800在操作和測量技術(shù)上的一些差異。這里我們介紹每個(gè)儀器能測量的數據以及它的用途。LI-600和LI-6800雖然有一些重疊，但各自都有自己的參數集，這意味著(zhù)每個(gè)特定實(shí)驗目的很大程度影響著(zhù)儀器的選擇。
LI-600PF和LI-6800F均可測得的參數
● 氣孔導度（gsw）：通過(guò)氣孔運輸水分的能力。氣孔對水分擴散阻力的反比。在生理學(xué)上，它提供了氣孔開(kāi)閉程度的相對測量方法，表示為單位時(shí)間單位葉面積的水分傳輸速率(mol H2O m-2 s-1)。但是要注意，在LI-600中，gsw測量的是葉片的單面，而在LI-6800中，測量的是葉片的兩面之和，除非使用單面測量套件（貨號9968-313）。要用LI-600測量總gsw，可以取葉片兩面的測量值并相加。gsw可以作為脅迫的敏感性指標，LI-600和LI-6800可以實(shí)時(shí)輸出該值。
● PSII的量子產(chǎn)率（ΦPSII）：在光系統II (PSII)中葉綠素吸收并用于光化學(xué)過(guò)程的光的比例，即當前光強下的實(shí)際量子效率。由于光誘導的非光化學(xué)猝滅過(guò)程的積累和葉片的光損傷，這個(gè)值通常會(huì )低于Fv/Fm。PSII的量子產(chǎn)率與碳同化密切相關(guān)，在C3植物中，PSII吸收光與Agross (Anet +Rd)的比值理論上至少為每個(gè)碳8個(gè)光子 。在非受脅迫植物中，偏離這一規律通?？蓺w因于其他能量耗損導致，如光呼吸、氮代謝或硫代謝。ΦPSII是光適應下測量葉綠素熒光得到的無(wú)量綱比例參數，LI-600PF或LI-6800F均可實(shí)時(shí)測得。
● 最大量子效率（Fv/Fm）：葉綠素在光系統II (PSII)中捕獲光能的最大光化學(xué)效率。一個(gè)高度保守且被廣泛引用的參數，它對脅迫引起的PSII反應中心的影響很敏感。對于健康的植物，Fv/Fm約為0.8，并隨著(zhù)影響能量捕獲或轉換的脅迫增加而降低。Fv/Fm是暗適應下測量葉綠素熒光得到的無(wú)量綱比例參數，LI-600PF或LI-6800F均可實(shí)時(shí)測得。由于LI-600 熒光計對環(huán)境條件開(kāi)放，因此在白天測量Fv/Fm時(shí)必須小心，不要將葉片暴露在光線(xiàn)下。
● 電子傳遞速率（ETR）：電子在電子傳遞鏈中線(xiàn)性移動(dòng)的速率，表示為速率(μmol electrons m-2s-1)，由葉綠素熒光測量得到。在C3植物中，ETR與Agross (Anet +Rd)的比值理論上至少為每個(gè)碳4個(gè)電子。偏離這個(gè)最小值通常是由于替代電子匯的影響，如光呼吸、氮代謝或硫代謝。ETR是通過(guò)測量光適應下葉片的葉綠素熒光參數計算得到，LI-600PF或LI-6800F均可實(shí)時(shí)測得。測量該參數需要用到LI-600或LI-6800的PAR傳感器，確保傳感器在測量過(guò)程中不被遮擋。
● 非光化學(xué)淬滅（NPQ）：與葉片在暗適應狀態(tài)相比，光下植物光系統II (PSII)通過(guò)非光化學(xué)途徑耗散的能量。NPQ可以被認為是葉片光化學(xué)過(guò)程無(wú)法利用的多余光能。在光強不增加的情況下，NPQ的增加代表光化學(xué)效率的降低。NPQ是通過(guò)植物在暗適應和光適應狀態(tài)下葉綠素熒光測量參數計算測得。在測得暗適應下最大熒光Fm后，LI-6800F可以直接輸出NPQ的值。LI-600F的NPQ值可以通過(guò)后期數據計算得到。
僅由LI-6800測得的參數
● 凈同化速率（Anet）：羧化作用的碳同化與光呼吸和其他呼吸過(guò)程造成的碳損失之間的凈變化值。碳同化用于支持植物的生長(cháng)和代謝，表示為單位時(shí)間單位葉面積的CO2吸收速率(μmol CO2 m-2 s-1)，可通過(guò)LI-6800實(shí)時(shí)測得。Anet通常是在模擬植物生長(cháng)環(huán)境的測量室中進(jìn)行測量。
● 光飽和同化速率（Asat）：光強不限制光化學(xué)過(guò)程時(shí)的凈同化速率；飽和光強下的凈同化速率。實(shí)現Asat的光強代表葉片的最大可用光強。表示為單位時(shí)間單位葉面積CO2吸收速率(μmol CO2 m-2 s-1)，該值可以來(lái)自飽和光強下的Asat點(diǎn)測量，也可以來(lái)自光響應(A-Q)曲線(xiàn)。
● 最大同化速率（Amax）：光和CO2都不限制光化學(xué)過(guò)程時(shí)的凈同化速率，飽和光強及飽和CO2濃度下的凈同化速率。Amax代表葉片的最大碳同化能力。表示為單位時(shí)間單位葉面積的CO2吸收速率(μmol CO2 m-2 s-1)，該值可以來(lái)自飽和條件下的Anet點(diǎn)測量，也可以來(lái)自CO2響應(A-Ci )曲線(xiàn)。
● 呼吸速率（RX）：由線(xiàn)粒體呼吸作用從葉片中流失碳的速率。單位時(shí)間單位葉面積CO2釋放速率(μmol CO2 m-2 s-1)。在C3植物中，有幾種估算線(xiàn)粒體呼吸的方法：光下呼吸速率，Rd，可以通過(guò)光響應曲線(xiàn)內嵌套CO2響應（A-Ci嵌套在A(yíng)-Q中）測量來(lái)估計。暗呼吸速率，Rn，可以由黑暗中的Anet測量值或光響應(A-Q)曲線(xiàn)的y軸截距來(lái)獲取。
● 光呼吸速率（RPR）：Rubisco加氧酶活性的結果。此時(shí)，Rubisco是加氧而不是羧化。光呼吸作用是一個(gè)與光合作用碳同化競爭的過(guò)程，并最終導致先前固定的碳的釋放。表示為單位時(shí)間單位葉面積CO2的釋放速率(μmol CO2 m-2 s-1)。目前有多種方法來(lái)估算RPR，包括CO2響應(A-Ci)曲線(xiàn)與葉綠素熒光耦合以及在低O2濃度下測同化作用。
● CO2總導度（gtc）：CO2通過(guò)氣孔和邊界層的運輸能力。CO2通過(guò)氣孔進(jìn)入葉片所受到的擴散阻力的反比。在生理學(xué)上，提供了一種隨著(zhù)邊界層阻力的影響氣孔開(kāi)閉程度的相對測量方法。表示為單位時(shí)間單位葉面積的CO2運輸速率(μmol CO2 m-2 s-1)。氣孔導度（gsw）是被更廣泛引用的導度參數。
● 水分利用效率（WUEg ）：凈同化速率（Anet）與氣孔導度（gsw）之比; 描述碳同化過(guò)程中潛在的水分消耗。與穩定碳同位素方法測定水分利用效率遵循的物理過(guò)程一樣，氣體交換測量能夠在更短的時(shí)間內測得水分利用效率。水分蒸發(fā)量與瞬時(shí)水分利用效率（WUEi）有關(guān)。WUEi可以用Anet和gsw計算得到，LI-6800默認輸出參數中不包含WUEi。
● 氣孔限制值（l ）：氣孔的擴散阻力對光合作用的固有限制。環(huán)境條件下測的同化速率與當葉片內部CO2濃度與環(huán)境CO2濃度一致時(shí)測得的同化速率的比例。通常由CO2響應（A-Ci）曲線(xiàn)而來(lái)。
● 最大羧化速率（Vcmax）：用于描述同化作用對CO2濃度的響應（A-Ci曲線(xiàn)），三個(gè)限速過(guò)程中的第一個(gè)過(guò)程。Vcmax表示Rubisco的最大固碳速度。它是通過(guò)擬合一個(gè)函數到A-Ci曲線(xiàn)的初始部分，其中CO2的可利用性限制了羧化速率。
● 最大電子傳遞速率（Jmax）：用于描述同化作用對CO2濃度的響應（A-Ci曲線(xiàn)）的第二個(gè)限速過(guò)程。Jmax表示通過(guò)電子傳遞鏈的最大電子傳遞速率(μmol electrons m-2s-1)。它來(lái)源于擬合的A-Ci曲線(xiàn)中光反應產(chǎn)生的ATP和NADPH限制羧化速率的那一部分。
● 磷酸丙糖利用率（VTPU）：用于描述同化作用對CO2濃度的響應（A-Ci曲線(xiàn)）的最后一個(gè)限速過(guò)程。磷酸丙糖利用率是對光合碳同化產(chǎn)物（磷酸丙糖）的輸出率，它們在蔗糖合成中的應用以及磷酸鹽返回葉綠體的評估。表示為速率（μmol triose phosphate m-2s-1），是擬合A-Ci曲線(xiàn)在A(yíng)max部分得到的參數。
■ 案例研究：野生辣椒的水分利用
本研究收集了大量野生辣椒品種，種植后對其農業(yè)性狀進(jìn)行篩選，其中，重點(diǎn)關(guān)注水分利用和對干旱脅迫的敏感性。
圖5 在溫室環(huán)境中隨機選擇不同的辣椒品種。從圖中也可看出表型范圍廣泛，一些表現出具有大而直立的葉片，而另一些則表現出狹窄的葉片和萎蔫的外觀(guān)。
在試驗中，將30份原材料分成3份，與一個(gè)商業(yè)對照品種(18個(gè)對照重復)一起種植。植物種植在2 L的花盆中，并在溫室條件下生長(cháng)。在研究開(kāi)始之前，所有植物保持水分充足。接下來(lái)，暫停灌溉，植物開(kāi)始受到水分脅迫。根據歷史數據，預先選擇干旱敏感品種和干旱不敏感品種的代表性樣本進(jìn)行詳細的表征分析。
在研究開(kāi)始之時(shí)，水分脅迫之前，首先在五個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)評估了整個(gè)種群107 株個(gè)體植物的氣孔導度 (gsw)。使用LI-600進(jìn)行測量，測量過(guò)程中注意確保葉片角度和葉片表面的光強不受測量影響。LI-600在短時(shí)間內快速完成了大量植物樣本的測量，在計劃時(shí)間表內完成每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的高樣本通量數據。
圖6 使用LI-600測定水分充足(左)和水分脅迫(右)植物的氣孔導度(gsw)。所有品種指的是整個(gè)種群(n=107)，從中選出干旱敏感(n=3)和干旱不敏感(n=3)品種。
氣孔導度與預期的日變化規律一致，在清晨表現出低導度，隨著(zhù)時(shí)間和光強的增加，氣孔開(kāi)始打開(kāi)。氣孔導度在中午之前達到峰值，隨著(zhù)溫度的升高，下午開(kāi)始下降(圖6)。在充足水分條件下，干旱敏感品種和普通品種之間的氣孔導度沒(méi)有差異。但是，可以觀(guān)察到對水分脅迫不敏感品種下午時(shí)的gsw下降幅度略小。
停止灌溉2天后，土壤明顯變干，再次分五個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量整個(gè)種群的氣孔導度(圖6)。此時(shí)，干旱敏感品種氣孔導度值在所有時(shí)間點(diǎn)都顯著(zhù)下降。相比之下，對干旱不敏感品種的氣孔導度值在所有時(shí)間點(diǎn)能夠仍然保持在整個(gè)種群平均值附近。
利用LI-6800光合作用系統對敏感品種和不敏感品種進(jìn)行了額外的多參數測量表征。在本研究中，使用LI-6800測量了光響應曲線(xiàn)，研究了在0-1800 μmol m-2 s-1范圍內10種不同光強梯度下CO2同化速率、氣孔導度和葉綠素熒光參數。光響應曲線(xiàn)測量過(guò)程中保持葉室內CO2濃度為400 ppm， VPD為1.5 kPa，葉片溫度為30 ℃（圖7所示）。
圖7 用LI-6800測量的光響應曲線(xiàn)(n=3)
A-Ci曲線(xiàn)采用動(dòng)態(tài)同化技術(shù)（DAT）測定。開(kāi)始之前，葉片在1500 μmol m-2 s-1光強（90%紅色，10%藍色）、30 ℃的葉溫、1.5 kPa VPD和1800 ppm 的參比室CO2濃度下適應。A-Ci響應曲線(xiàn)表明，干旱敏感植物的凈同化速率仍然較高，最大同化速率在40 μmol m-2 s-1左右。而干旱不敏感植物的凈同化要低得多，最大值在25 μmol m-2 s-1左右（圖8）。
從這些曲線(xiàn)獲取的參數看，相比不敏感品種氣孔限制值增加0.122，干旱敏感品種的氣孔限制值增加-0.250。
當查看氣孔導度 (gsw) 與凈同化速率A（圖 9上）關(guān)系時(shí)，我們觀(guān)察到兩個(gè)參數之間存在很強的線(xiàn)性相關(guān)性。受到水分脅迫前，干旱敏感品種和不敏感品種之間無(wú)明顯種間差異，斜率分別為77.7和78.3。干旱處理后，兩個(gè)種群開(kāi)始分化。兩種品種的固有水分利用效率均有所提高；但相比敏感品種（斜率為102.4），不敏感品種的斜率更大，為112.5。
圖8 LI-6800采集的A/Ci曲線(xiàn)(n=3)
圖9 水分脅迫前（上）、脅迫后（下）的A vs.gsw
結論
● LI-600在5個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)每個(gè)點(diǎn)收集107個(gè)測量值，一天之內就能獲取535個(gè)觀(guān)測值。通過(guò)結合使用這兩種儀器，我們可以做出比單獨使用任何一種儀器更完整的性狀圖。
● 從圖9可以看出同化速率與氣孔導度之間存在較強的相關(guān)關(guān)系。一旦建立了這樣的關(guān)系，我們就可以使用LI-600快速收集大量氣孔導度的數據，并推斷大量植物中葉片的可能同化速率情況。
■ 在線(xiàn)研討會(huì )通知
LI-600能在不控制環(huán)境條件下，5-15s內準確測量葉片的氣孔導度和葉綠素熒光參數。
LI-6800能在可控環(huán)境條件下，測量葉片凈光合速率、CO2和光響應曲線(xiàn)、高頻葉綠素熒光及其他光合生理參數。
兩者聯(lián)用，將會(huì )顯著(zhù)提高測量效率。
LI-COR公司高級應用科學(xué)家Jason Hupp，將和大家分享兩者的聯(lián)用優(yōu)勢和相關(guān)應用案例。
時(shí)間：2021年9月29日 上午10:00-11:00 （第一場(chǎng)）
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