文章標題
Guard cell activity of PIF4 and HY5 control transpiration
保衛細胞中PIF4及 HY5的活性調控蒸騰
https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2022.111583
作者 |Gilor Kelly等
翻譯 | 王露
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摘要
植物的蒸騰作用涉及到植物水力學(xué)以及植物氣孔運動(dòng)相關(guān)背景。蒸騰過(guò)程會(huì )受到內源以及外界環(huán)境信號的調節，而在眾多環(huán)境因子中，光起著(zhù)主導作用。
光強，光質(zhì)都會(huì )影響氣孔孔徑的大小。如何調控孔徑讓植物攝入CO2的量佳，且如何讓植物水分耗散量最小，這些問(wèn)題值得思索。盡管光環(huán)境變量與蒸騰之間的關(guān)系已有深入研究，但在遺傳層面，保衛細胞如何感知這些信號，以及感受信號之后又如何影響氣孔導度，目前這部分研究有所局限。
而在該研究中要點(diǎn)關(guān)注兩個(gè)關(guān)鍵的光響應轉錄因子HY5和PIF4，它們分別屬于bZIP家族以及BHLH家族。該研究發(fā)現在擬南芥保衛細胞中過(guò)表達PIF4，會(huì )導致蒸騰作用降低，在pif4突變體中的表達甚至會(huì )抑制蒸騰作用。HY5在野生型擬南芥，煙草，以及hy5擬南芥突變體的保衛細胞中過(guò)表達，會(huì )提高蒸騰速率。此外，在擬南芥中發(fā)現HY5可逆轉己糖激酶HXK1過(guò)表達導致的蒸騰速率降低的情形。
1.研究背景
植物水分管理主要通過(guò)蒸騰作用進(jìn)行調節，植物蒸騰會(huì )受到內源信號與環(huán)境信號共同調節，其中光起著(zhù)主要的作用。當光出現時(shí)，光信號會(huì )刺激葉片氣孔打開(kāi)并且會(huì )啟動(dòng)葉片與大氣之間的日常氣體交換。光在一天中持續影響植物氣孔導度，進(jìn)而影響每天的氣體交換速率（H2O以及CO2的擴散）。
光質(zhì)也會(huì )影響氣孔的開(kāi)閉。氣孔打開(kāi)大多是由單色藍光啟動(dòng)，較小程度上由紅光和遠紅光啟動(dòng)，在紅光背景中添加藍光可增強晝夜氣孔導度，但與單獨使用紅光相比，會(huì )阻礙整體水分利用效率。為響應光環(huán)境變化，植物的藍光與紅光受體接收到相應信號會(huì )控制氣孔運動(dòng)以及氣孔導度，該過(guò)程的下游元件調控的遺傳學(xué)背景，主要來(lái)源于幼苗光形態(tài)建成階段的研究。一些參與光信號轉導的轉錄因子被證明是光形態(tài)發(fā)生中的關(guān)鍵節點(diǎn)，比如光敏色素相互作用因子PIF。
PIF類(lèi)因子在光信號感知以及信號轉換中起到重要的作用。而PHYB（PHYTOCHROME）是PIF的上游調節因子，通過(guò)調節氣孔密度以及氣孔導度，減少水分流失，進(jìn)而提高植物的耐旱性。突變體Phyb相比野生型植株而言氣孔更加閉合，而突變體pif3，突變體pif4，相比野生型氣孔更加打開(kāi)。PIF類(lèi)的轉錄因子可能處于PHYB的下游，根據光環(huán)境變化調控氣孔導度。而目前相關(guān)研究表明在高溫環(huán)境下，PIF4作為負調控因子調控氣孔發(fā)育。下胚軸伸長(cháng)因子HY5，與PIF類(lèi)起拮抗作用。
光會(huì )阻止HY5的降解，HY5的靶定目標是PIF4，HY5會(huì )使得PIF4進(jìn)行降解，所以在缺光的條件下，會(huì )通過(guò)PIF類(lèi)因子促進(jìn)下胚軸伸長(cháng)。廣泛的遺傳育種以及生化研究已證實(shí)HY5控制光調節轉錄變化，超過(guò)1/3的基因組會(huì )受到轉錄因子HY5的調控作用，但目前缺少HY5參與全植物蒸騰管理以響應光變化的作用研究。盡管缺乏與HY5相關(guān)的蒸騰數據，有研究表明HY5會(huì )影響氣孔發(fā)育，發(fā)現HY5會(huì )靶定到STOMAGEN基因上，從而誘導表皮層中氣孔發(fā)育，進(jìn)而導致氣孔密度以及氣孔指數（氣孔與表皮細胞的比率）的增加。
然而，有研究表明HY5影響氣孔發(fā)育是有限制條件的，認為其跟植物接收到的日照時(shí)長(cháng)相關(guān)，只有在長(cháng)日照的環(huán)境條件下，HY5調控植物響應光信號進(jìn)而控制氣孔發(fā)育，在短日照生長(cháng)條件下沒(méi)有影響。這些研究表明在HY5調控作用下，氣孔感知光信號的不確定性，也同樣表明HY5在蒸騰作用中提供了額外的動(dòng)力。
除了光以外，糖也會(huì )影響下胚軸伸長(cháng)。己糖激酶1是一種葡萄糖磷酸化酶，除催化作用外，還會(huì )介導糖感應，并支持糖誘導的下胚軸生長(cháng)。編碼的己糖激酶1基因HXK1會(huì )在保衛細胞中進(jìn)行特異性表達，導致下胚軸比野生型幼苗長(cháng)三倍。除下胚軸生長(cháng)以外，HXK1的表達大約減少20%的蒸騰作用。
擬南芥Col-0生態(tài)型,pif4-101,hy5,
GCHXK,GCGFP,GCPIF4/pif4
GCHY5/hy5,GCHKX/GCHY5,
GCHXK/GCHY5/hy5,GCHXK/hy5,GCHY5-GFP,GCHXK/GCHY5-GFP
所有擬南芥光照條件，光強為150 μmol m-2 s-1，10個(gè)小時(shí)光照。溫度在20-22?C，濕度50% - 60%。擬南芥栽培基質(zhì)為30%的蛭石，30%的泥炭，20%的凝灰巖，20%的珍珠巖的混合基質(zhì)。煙草栽培基質(zhì)為70%的凝灰巖，30%的泥炭的混合基質(zhì)。擬南芥種植時(shí)間為2020年1月至2月，煙草種植時(shí)間為2019年9月，栽培地為半控制自然光條件下的溫室。
構建含有保衛細胞的特異性啟動(dòng)子
KST1（KSTppro::AtHY5）的HY5基因表達載體，使用農桿菌轉化法侵染煙草葉盤(pán)。
該試驗使用功能表型系統平臺，測定全植物每日的蒸騰速率。將野生型或者轉基因的擬南芥或者煙草，每棵煙草單獨種植在3.9L的盆中，每4棵擬南芥種植在3.9L的盆中。每個(gè)盆放置在稱(chēng)重單元上密封，防止生長(cháng)培養基表面蒸發(fā)，每10s會(huì )采集1次數據，將3min以?xún)炔杉臄祿銎骄M(jìn)行下一步分析。將植物的蒸騰速率標準化為重量或者總葉面積。在整個(gè)試驗過(guò)程檢測光合有效輻射PAR值，以及飽和水汽壓虧缺VPD值。試驗結束后對植物進(jìn)行干重測量。
使用LI-600熒光氣孔計（LI-COR,USA）測量蒸騰速率與氣孔導度，使用LI-6800便攜式光合儀（LI-COR,USA）進(jìn)行葉片氣體交換測量分析，測量過(guò)程控制環(huán)境變量，光強在200 μmol m-2 s-1，二氧化碳濃度在400 μmol mol-1。藍光光合有效光量子通量密度設置在5%，流量設置為150 μmol/s，飽和水汽壓虧缺在1-1.1kPa之間，葉片溫度在22?C。
對于圖1、圖4中描述的葉面積測量，移除葉子，移除整個(gè)蓮座結，使用LI-3100（LI-COR,USA）葉面積儀確定分析面積，使用ImageJ軟件
全葉蒸騰速率E除以葉片水勢Δ leaf，計算每片葉子的Kleaf。Δleaf =?Ψleaf，光處理 – Ψleaf，暗處理。E測量完畢后將葉子轉移到壓力室（ARIMAD-3000, Israel）來(lái)確定?Ψleaf，光處理。然后將同一植物的另外一片葉子完全覆蓋錫箔紙，轉移到壓力室去測量Ψleaf，暗下，測量在10:00-13:00（開(kāi)燈后1-4個(gè)小時(shí)）進(jìn)行。
使用Leica SP8激光掃描顯微鏡（Leica，German）對GCHY5-GFP成熟植物進(jìn)行圖像采集，使用488nm激光獲取GFP信號圖像，Hyd檢測器在500-525nm范圍內檢測發(fā)射。使用PMT檢測器在650-750nm范圍內檢測葉綠體的自發(fā)熒光。
對于氣孔密度和指數測量，去除表皮并立即進(jìn)行成像，每個(gè)生物學(xué)重復隨機選擇三個(gè)區域進(jìn)行掃描和平均（n=10）。在每個(gè)區域中，氣孔和表皮細胞，均在明場(chǎng)倒置顯微鏡下成像（1M7100 Zeiss,Germany）。顯微鏡上安裝有HV-D30CCD（Hitachi,Japan）顯微鏡尺（Olympus, Japan）用于校準尺度。
使用JMP 16軟件進(jìn)行統計分析，使用Student t檢驗、Tukey的HSD檢驗或Dunnett方法比較平均值。當P<0.05時(shí)，平均值被認為存在顯著(zhù)差異。
3.結果
植物的光反應由PIF4和HY5等轉錄因子介導，PIF4促進(jìn)下胚軸伸長(cháng)，HY5則阻礙下胚軸伸長(cháng)，HY5和PIF4存在對光的特異性反應，而光對蒸騰作用影響較深，所以探究HY5和PIF4對植物蒸騰作用的影響。假設PIF4與HY5轉錄因子以拮抗作用的方式改變蒸騰作用。使用氣體分析儀測定轉基因擬南芥的AtPIF4（GCPIF4）或AtHY5（GCHY5）植物的蒸騰速率，在擬南芥WT植物的保衛細胞中，GCPIF4植物表現出較低的氣孔導度和蒸騰速率（圖1，A與B）。雖然低蒸騰量可能會(huì )導致生長(cháng)抑制，但是沒(méi)有在GCPIF4植物中觀(guān)察到生物量的減少（圖1，C與D）。
圖1 擬南芥，WT為野生型，#4，#5，兩個(gè)不同的轉基因株系，GCPIF4為在保衛細胞中特異性表達的基因。圖A為蒸騰速率的變化，圖B為氣孔導度的變化，圖C為干重的變化，圖D為葉面積變化的箱線(xiàn)圖。方框內的線(xiàn)表示中值（n=8-10）。星號表示轉基因株系相對于野生型的顯著(zhù)差異（Dunnett檢驗，P<0.05）。
與GCPIF4植物相反的是，與WT相比，GCHY5植物表現出更高的蒸騰速率和氣孔導度（圖2，A與B），植物出現了生長(cháng)抑制（圖2，C）。
圖2 圖ABC為擬南芥植物，圖DEF為煙草植物。圖A為野生型與轉基因不同株系的蒸騰速率，圖B為野生型與轉基因不同株系的氣孔導度，圖C為野生型與轉基因不同株系的干重。圖ABC方框內線(xiàn)為中值（n=8-12）。圖D為日動(dòng)態(tài)變化下的飽和水汽壓虧缺與光合有效輻射值，圖E為蒸騰速率的日動(dòng)態(tài)變化，圖F為日中（10:00-12:00）蒸騰速率變化，圖F方框內線(xiàn)中值為（n=17-18）。星號表示轉基因株系相對于野生型的顯著(zhù)差異（Dunnett檢驗，P<0.05）。
在保衛細胞中瞬時(shí)表達HY5-GFP融合基因，也觀(guān)察到類(lèi)似現象（圖3），在成熟葉子的保衛細胞中觀(guān)察到GFP熒光信號（圖3，A），且出現較高的氣孔導度（圖3，C），和生長(cháng)抑制（圖3，D與E）。這些結果進(jìn)一步表明GCHY5會(huì )促進(jìn)蒸騰。為了探究HY5轉錄因子的作用，以及其對蒸騰作用的影響，在煙草中轉入GCHY5基因，其中GCHY5含有保衛細胞特異性啟動(dòng)子，在保衛細胞中表達。通過(guò)使蒸滲儀刻度系統，連續監測轉入GCHY5基因植物的全株晝夜蒸騰行為，連續測量水分耗散，光強和飽和水汽壓虧缺日動(dòng)態(tài)變化（圖2，D），以及蒸騰速率（圖2，E）。在擬南芥日動(dòng)態(tài)蒸騰速率監測中，發(fā)現在上午轉入GCHY5基因的蒸騰速率高于野生型WT（圖2，E與F）。結果進(jìn)一步支持HY5基因在保衛細胞中特異性表達進(jìn)而提高蒸騰速率。
圖3 在成熟葉片葉肉保衛細胞中瞬時(shí)表達HY5，增強氣孔導度，阻止生長(cháng)。圖AB，含有編碼綠色熒光蛋白GFP的融合基因的轉基因株系。HY5-GFP在表皮中分布，白色箭頭表示目標基因在保衛細胞中的位置（染成綠色），橙色箭頭表示目標基因在葉肉細胞的位置（染成洋紅色），白色比例尺為50μm。圖CDE為野生型與轉基因株系的不同指標，圖C為野生型與轉基因株系的氣孔導度，圖D為野生型與轉基因株系的干重，圖E為野生型與轉基因株系的蓮座面積。
pif4擬南芥突變體比野生型WT有著(zhù)更高的氣孔導度和蒸騰速率，但在pif4突變體中再轉入GCPIF4，就會(huì )抑制氣孔導度與蒸騰速率的高表達。測量轉入GCPIF4的pif4突變體的光合速率，發(fā)現其光合速率與野生型pif4突變體中表達相差不大（圖4，C），轉基因植物與突變體相比，光合速率變化不大，蒸騰速率降低，由此而導致其水分利用效率有所提高（圖4，D）。在轉入GCPIF4的pif4突變體中，蒸騰作用降低不會(huì )使植株生物量受損（圖4，E與F）。
結果表明光敏色素轉錄因子PIF4在植物蒸騰作用中起到核心作用，此外在保衛細胞中表達的GCPIF4，不會(huì )受到存在于其他組織細胞中的PIF4的影響。
圖4 在pif4突變體中轉入GCPIF4進(jìn)行補充驗證，轉入之后發(fā)現植株水分利用效率有所增強。圖A到D分別為不同樣本的氣孔導度，蒸騰速率，光合速率，以及水分利用效率的變化。WT為野生型擬南芥，pif4為突變體，GCPIF4/pif4 #5為在突變體中轉入GCPIF4進(jìn)行補充驗證的轉基因5號株系，GCPIF4/pif4 #15，為轉基因15號株系。方框內線(xiàn)為中值（A到D，n=6-12。EF，n=8-12）。采用Tukey's HSD檢驗，P ?<0.05不同字母表示差異顯著(zhù)。
3.3 在突變體hy5的保衛細胞中過(guò)表達GCHY5會(huì )提高蒸騰速率
采用蒸滲系統測量全株植物的蒸騰速率，測量在hy5突變體保衛細胞中過(guò)表達ATHY5的蒸騰速率。GCHY5/hy5植物相比突變體hy5和野生型植物WT，一天中蒸騰速率顯著(zhù)增加（圖5，A）。日中蒸騰速率（平均12:00-14:00），當蒸騰處于峰值時(shí)，轉基因株系GCHY5/hy5 #7 ，轉基因株系GCHY5/hy5 #12，分別比擬南芥突變體hy5高25%，9%。結果表明在保衛細胞中HY5轉錄因子對蒸騰作用起到正向調節。
GCHY5/hy5植物與hy5突變體光合能力相似（圖5，C），但這些轉基因株系蒸騰速率較高，所以水分利用效率IWUE相對較低。只在轉基因株系GCHY5/hy5 #12中發(fā)現干重顯著(zhù)降低，阻礙了生物量的增長(cháng)（圖5，E）。與WT背景下過(guò)表達GCHY5相比，GCHY5在突變體hy5內對植物生長(cháng)的影響是微弱的（圖2，C）（圖3，D與E）。
圖5 在擬南芥hy5突變體中轉入GCHY5促進(jìn)蒸騰，樣本為擬南芥野生型WT，突變體hy5，以及在hy5突變體保衛細胞中特異性表達hy5的轉基因株系，轉基因株系GCHY5/hy5 #12，轉基因株系GCHY5/hy5 #7。圖A為四類(lèi)樣本蒸騰速率日變化動(dòng)態(tài)，圖B為四類(lèi)樣本日中（12:00-14:00）蒸騰速率的平均值（n=6），圖C為四類(lèi)樣本的光合速率，圖D為四類(lèi)樣本的水分利用效率IWUE。圖B與E箱線(xiàn)圖中值為6，圖C與D箱線(xiàn)圖中值為6-8。星號表示相對于hy5而言有著(zhù)顯著(zhù)差異（Dunnett檢驗，P<0.05）。
保衛細胞中的HY5轉錄因子促進(jìn)蒸騰作用，有研究表明，轉錄因子GCHY5可抵消由己糖激酶HXK引導的幼苗下胚軸伸長(cháng)效應。在幼苗中GCHY5會(huì )終止下胚軸生長(cháng)，HXK不僅會(huì )促進(jìn)下胚軸生長(cháng)，且在成熟植物中會(huì )導致20%的蒸騰速率降低。本研究探討在植物中GCHY5能否逆轉GCHXK導致的蒸騰降低作用。GCHY5/GCHXK/WT為野生型植株背景下共轉入GCHY5/GCHXK。GCHY5/GCHXK/hy5在hy5突變體背景共轉入GCHY5/GCHXK。
結果表明在野生型植物背景下共轉入GCHY5/GCHXK的植物蒸騰速率高于僅轉入GCHXK的樣本。說(shuō)明GCHY5在野生型植物的背景下表達可逆轉GCHXK引發(fā)的低蒸騰量（圖6，A與B）,但在hy5突變體背景下，GCHXK/GCHY5/hy5的蒸騰速率與GCHXK的植株一樣蒸騰速率較低，也許僅在保衛細胞HY5轉錄因子調控，不足以逆轉GCHXK誘導的低蒸騰作用，GCHY5的逆轉作用的發(fā)生也許同樣需要其他組織細胞中存在A(yíng)tHY5。
在GCHY5/GCHXK/WT與GCHXK/GCHY5/hy5樣本中，葉片水力傳導率Kleaf與野生型植物的并無(wú)顯著(zhù)差異，而GCHXK樣本中的Kleaf顯著(zhù)增加，與之前研究相似。另外之前研究轉入GCHY5會(huì )提高蒸騰作用，而這與葉片的水力導度沒(méi)有明顯關(guān)系。
圖6 GCHY5逆轉GCHXK的低蒸騰作用的能力取決于內源AtHY5的表達，對葉片水力傳導。圖A在GCHXK/GCHY5/hy5，GCHXK/GCHY5/WT，GCHXK，WT樣本下的蒸騰速率，圖B在GCHXK/GCHY5/hy5，GCHXK/GCHY5/WT，GCHXK，WT樣本下的日中（12:00-14:00）蒸騰速率，平均值（n=6），箱線(xiàn)圖中值（n=6），圖C為在GCHXK/GCHY5/hy5，GCHXK/GCHY5/WT，GCHXK，WT樣本下的葉片水力傳導率Kleaf，箱線(xiàn)圖中值（n=10-14）。星號表示與野生型相比有顯著(zhù)影響
使用保衛細胞特異性啟動(dòng)子，在保衛細胞中特異性表達，PIF4降低蒸騰速率，HY5則會(huì )提高蒸騰速率。除了特異性啟動(dòng)子，最近研究表明PIF在組成型啟動(dòng)子下表達也會(huì )影響蒸騰。在玉米以及胡蘿卜中過(guò)表達ZmPIF3、ZmPIF1和DcPIF3導致蒸騰作用降低，但耐旱性有所提高。在pif3，pif4擬南芥雙突變體中，氣孔孔徑大于野生型植株。